Para poder proceder al aislamiento de células mononucleares humanas existen diferentes protocolos, en esta ocasión nos vamos a centrar en el que se desarrolla mediante gradiente de Ficoll-1077.
El protocolo es eficaz en el procesamiento de muestras procedentes de concentrados leucocitarios derivadas de bancos de sangre, así como de muestras de sangre entera recolectadas con tubos de extracción al vacío. El procedimiento deberá realizarse dentro de un gabinete de seguridad biológica clase II A/B3 y, preferentemente dentro del cuarto de cultivo celular para aquellas muestras destinadas a transformación hacia líneas celulares.
Dado que el procedimiento ha sido optimizado para temperaturas de procesamiento entre 18 y 20 °C, la centrífuga que se utilice deberá de ser refrigerada y además los portatubos deberán disponer de tapas para contención de aerosoles.
Como recomendaciones adicionales para obtener el mejor resultado, Ortoalresa propone:
– en el momento de cargar la muestra en el tubo de Ficoll-1077, déjela escurrir por las paredes del tubo inclinado. Para asegurarse que se ha hecho adecuadamente, comprobar que el tubo cónico presenta dos estratos, uno inferior con Ficoll-1077 y uno superior con la mezcla de sangre y PBS.
– seleccionar el parámetro de velocidad en los diferentes procesos en RCF (xg).
– aplicar la desaceleración lenta para la parada del equipo, así evitaremos que se remueva la muestra.
La gran ventaja que presenta este procedimiento es la disminución del número de linfocitos que son secuestrados por los eritrocitos agregados y por lo tanto maximizar su recuperación.
Conseguiremos así tener un alto rendimiento de células mononucleares humanas viables tanto para las líneas de investigación, como para su transformación hacia líneas celulares.
